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1 CRISPR-Cas系统的发现有规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)广泛存在于绝大多数细菌和古细菌中，其转录产生的crRNA(CRISPR-RNA)与反式激活的tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)共同构成引导RNA(guide RNA, gRNA)，gRNA可引导核酸内切酶Cas蛋白(CRISPR associated protein)对噬菌体的基因片段进行切割，构成细菌的CRISPR-Cas免疫防御系统。人们发现可以通过人工合成的gRNA模拟自然的tracrRNA和crRNA结构，与Cas蛋白一起特异性识别和剪切核酸序列，构成新一代的基因编辑技术。2013年，2个团队[1-2]首次使用嗜热链球菌和化脓性链球菌构建Ⅱ型CRISPR-Cas9系统，随后该系统日趋成熟，并被广泛用于哺乳动物细胞的基因组编辑。 2015年，该家族内的另一系统CRISPR-CasC2c2[3](现称Cas13)被成功鉴定，与Cas9不同， Cas13结合和切割的对象为RNA。目前科学家们已经从Leptotrichiabuccalis(Lbu)、Leptotrichiawadei(Lwa)、Leptotrichiashahii(Lsh)以及Lachnospiraceaebacterium(Lba)等多种细菌中解析出了Cas13a结构，根据其来源不同分别称为LbuCas13a[4]、LwaCas13a[5]、LshCas13a[6]和LbaCas13a[7]。2 CRISPR-Cas系统的分类目前CRISPR-Cas系统分为2类、6型和30多种亚型[8]。其中1类系统(包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型)具有多个亚单位效应复合物，包括多个Cas蛋白；而2类系统(包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型)中效应物是种类单一、体积较大、多结构域的蛋白分子[9](见中插彩版图1)。研究表明，所有的CRISPR-Cas系统可能来源于同一个祖先，1类系统在进化过程中变为具有单一功能的Cas基因，同时丢失其他的Cas基因从而形成2类系统[10]。CRISPR-Cas13系统属于2类CRISPR系统的Ⅵ型，根据结构还可再细分为a、b、c、d四个亚型。图1 两类CRISPR-Cas系统的结构差异及主要组成[9]3 CRISPR-Cas13系统的作用机理以CRISPR-Cas13a系统为例，高分辨率结构分析[4]显示细菌Leptotrichiabuccalis(Lbu)中解析出的LbuCas13a属于“双瓣叶”球状蛋白质结构，由1个crRNA识别瓣叶(Recognition lobe, REC)和1个核酸酶瓣叶(Nuclease lobe, NUC)组成，其NUC上有2个高等真核生物和原核生物核苷酸结合域(Higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding, HEPN)。图2 LbuCas13a、crRNA、靶RNA复合物的复合结构[4]A：LbuCas13a的结构域 ； B：crRNA-靶RNA组成的双链RNA结构 ； C：LbuCas13a-crRNA-靶RNA组成整体结构的前后视图Cas13a效应蛋白在识别靶RNA上的前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)(在Cas13a中称为Protospacer flanking site,PFS)并与其结合的过程中可发生构象变化，HEPN1结构域在靶RNA结合后向HEPN2方向移动，形成一个活化的HEPN催化位点。活化的HEPN催化位点表现出两种核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)活性，一种可将自身的pre-crRNA处理为crRNA，令一种表现为HEPN-RNase活性，对靶RNA或游离RNA进行切割[4]。图3 Cas13a构象改变和HEPN活化以及表现RNase活性的过程[4]Cas13a的催化位点位于外表面，所以一旦Cas13a被靶标RNA结合激活，就可以发挥非特异性RNA酶功能，裂解任何可触及的单链RNA(single-stranded RNA, ssRNA)，而不论它们是否与crRNA同源或是否存在PFS，这种效应称为附带切割效应(Collateral effect)。相比之下，Cas9和Cas12只能在其HNH或RuvC两个核酸酶催化位点的引导链(gRNA)上切割靶标双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)[4]。Cas13b同样包含2个HEPN结构域，因此有类似Cas13a的功能，Cas13d在大多数方面表现与先前研究的Cas13类似，而Cas13c相关研究较少[11]。4 CRISPR-Cas13技术的应用自2015年C2c2(现称Cas13)系统被发现以来，其研究突飞猛进，并于2017年被《Nature Methods》评为2016年度革新技术[12]。该靶向RNA的核酸编辑技术在多个领域均有所应用 RNA示踪 Cas13a蛋白的HEPN 结构域中Arg(精氨酸)和His(组氨酸)突变可形成核酸酶活性缺失的dCas13a(dead Cas13a)，其能够结合目标RNA但不切割，因此成为一个可编程的RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)，利用其与特定RNA序列的结合特性，配合荧光标记技术可对胞内特定RNA片段进行示踪[13] 临床诊断 通过设计与目标核酸互补的gRNA，并与Cas13蛋白组装可组成RNA检测报告系统。其报告基因通常一端为荧光基团，另一端是化学猝灭剂，当报告基因与样品中的特异性靶标核酸结合时，Cas酶将对报告基因进行裂解，从猝灭剂中释放荧光基团发出荧光，且信号可量化。利用该技术可对待测基因进行精确测量或定性分析[14]。图4 应用报告基因reporter进行核酸检测[14]利用Cas13在靶识别时表现出的附带切割效应，Gootenberg[15]等通过设计报告基因并结合恒温核酸依赖性扩增检测技术(Nuclear acid sequence-based amplification, NASBA)建立了基于CRISPR的诊断系统(CRISPR-based diagnostic, CRISPR-dx)。其可提供渺摩尔级(attomolar, aM, 10-8mol/L)的具有单碱基错配敏感性和特异性的快速核酸(DNA或RNA)检测方法。该方法既可用于基因组中单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)分析，也可用于监测血液中极少量的肿瘤 DNA。鉴于其高敏感性，该系统被称为SHERLOCK(Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)，可被用于检测寨卡和登革热病毒的特定毒株以及区分不同的其他病原菌。其后，该团队继续研究出了进一步优化的SHERLOCK version2(SHERLOCK v2)[16]。近期，河南农业大学常亚飞[17]等利用SHERLOCK系统，通过结合LwCas13a附带切割效应和重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)技术，建立一种可以在37 ℃下恒温进行猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测的方法。该方法具有恒温反应、灵敏、特异、结果直观、利于现场操作的特点。同时，由于SHERLOCK高度的错配敏感性，该技术可对序列高度同源的病毒株进行区分 基于CRISPR-Cas13的抗病毒研究 与Cas9 系统对DNA 病毒核酸的切割破坏效应相似，Cas13的RNA特异性靶向切割能力可用于拮抗RNA病毒，以及复制过程中有RNA中间体的DNA病毒。Rashid Aman[18]以及Xiaohui Zhan[19]等人最早用LshCas13a系统干扰芜菁花叶病毒(TuMV)以及马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)等植物病毒的复制增殖。近期Freije等[20]证明Cas13可被用于靶向和破坏多种感染哺乳动物的ssRNA病毒的基因组。该研究通过生物信息学技术对数百种可能感染人类的ssRNA病毒进行分析，并预测了数千个Cas13 crRNA的潜在靶点，同时经实验证实Cas13可拮抗淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)、甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)和水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)这3种不同的ssRNA病毒的增殖和复制。此外，该研究还分析了介导Cas13靶向作用的影响因素，确定了crRNA设计标准，进一步优化了该抗病毒方法，为后期该技术在抗病毒领域的广泛应用奠定了重要基础。5 展望基于CRISPR-Cas13系统的核酸检测以及抗病毒技术将在兽医研究领域大有可为，原因有三：(1)SHERLOCK检测系统具有高灵敏度、特异性、可恒温反应、结果直观、利于现场操作的特点，非常利于开发可在养殖场和动物医院现场使用的核酸检测试纸条，这为开发轻量化、便捷的检测技术提供了重要思路；(2)SHERLOCK具有高度的错配敏感性，该技术可对序列高度同源的病毒株进行区分；(3)基于CRISPR-Cas13的抗病毒策略在动物疫病的预防治疗研究中较人类有更低的试错成本。同时，该技术还可与转基因抗病育种技术相结合，以培育对某种疾病具有天然抗性的动物。虽然CRISPR-Cas13技术的发展突飞猛进，但目前该技术仍有诸多不足有待解决。首先，sgRNA对靶位点的正确识别需要特定PAM序列，降低了靶区选择和相应sgRNA设计的灵活性，也使sgRNA的设计更加复杂化。其次，crRNA与目标核酸序列的结合可容忍一定程度的错配，进而导致脱靶效应(off-target effect)，阻碍了 CRISPR-Cas系统在生产实践中的使用。当前主要通过sgRNA和PAM序列的设计以及CRISPR系统的优化(Cas的构象和Cas-sgRNA的用量等)3个方面进行降低脱靶效率的研究来提升其作用的准确性。再者，基因编辑效率(efficiency of genome editing)的提高对于CRISPR-Cas基因编辑技术的开发应用同样重要。此外，由于RNA酶的广泛存在，核酸的检测和编辑很容易受到影响，因此，在CRISPR-Cas系统中偏向使用更长的sgRNA来放大核酸检测信号，以确保sgRNA没有被RNase消化变短或降解，从而有效避免假阴性结果[21]。而CRISPR-Cas13技术若想真正用于临床开发，其Cas13 蛋白以及gRNA在体内的精确递呈、代谢消除、免疫激活反应以及其他安全性相关指标均需要系统评估。若能解决以上诸多问题，将有利于Cas13技术的进一步完善，为传染病快速、准确的诊断以及抗病毒药物的开发提供新的思路和技术。参考文献：[1] Cong L, Ran F A, Cox D,etal. 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文章来源：《中华疾病控制杂志》 网址: http://www.zhjbkzzz.cn/qikandaodu/2020/1222/522.html

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