利用Cas13在靶识别时表现出的附带切割效应，Gootenberg[15]等通过设计报告基因并结合恒温核酸依赖性扩增检测技术(Nuclear acid sequence-based amplification, NASBA)建立了基于CRISPR的诊断系统(CRISPR-based diagnostic, CRISPR-dx)。其可提供渺摩尔级(attomolar, aM, 10-8mol/L)的具有单碱基错配敏感性和特异性的快速核酸(DNA或RNA)检测方法。该方法既可用于基因组中单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)分析，也可用于监测血液中极少量的肿瘤 DNA。鉴于其高敏感性，该系统被称为SHERLOCK(Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)，可被用于检测寨卡和登革热病毒的特定毒株以及区分不同的其他病原菌。其后，该团队继续研究出了进一步优化的SHERLOCK version2(SHERLOCK v2)[16]。

近期，河南农业大学常亚飞[17]等利用SHERLOCK系统，通过结合LwCas13a附带切割效应和重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)技术，建立一种可以在37 ℃下恒温进行猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测的方法。该方法具有恒温反应、灵敏、特异、结果直观、利于现场操作的特点。同时，由于SHERLOCK高度的错配敏感性，该技术可对序列高度同源的病毒株进行区分。

4.3 基于CRISPR-Cas13的抗病毒研究 与Cas9 系统对DNA 病毒核酸的切割破坏效应相似，Cas13的RNA特异性靶向切割能力可用于拮抗RNA病毒，以及复制过程中有RNA中间体的DNA病毒。Rashid Aman[18]以及Xiaohui Zhan[19]等人最早用LshCas13a系统干扰芜菁花叶病毒(TuMV)以及马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)等植物病毒的复制增殖。近期Freije等[20]证明Cas13可被用于靶向和破坏多种感染哺乳动物的ssRNA病毒的基因组。该研究通过生物信息学技术对数百种可能感染人类的ssRNA病毒进行分析，并预测了数千个Cas13 crRNA的潜在靶点，同时经实验证实Cas13可拮抗淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)、甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)和水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)这3种不同的ssRNA病毒的增殖和复制。此外，该研究还分析了介导Cas13靶向作用的影响因素，确定了crRNA设计标准，进一步优化了该抗病毒方法，为后期该技术在抗病毒领域的广泛应用奠定了重要基础。

5 展望

基于CRISPR-Cas13系统的核酸检测以及抗病毒技术将在兽医研究领域大有可为，原因有三：(1)SHERLOCK检测系统具有高灵敏度、特异性、可恒温反应、结果直观、利于现场操作的特点，非常利于开发可在养殖场和动物医院现场使用的核酸检测试纸条，这为开发轻量化、便捷的检测技术提供了重要思路；(2)SHERLOCK具有高度的错配敏感性，该技术可对序列高度同源的病毒株进行区分；(3)基于CRISPR-Cas13的抗病毒策略在动物疫病的预防治疗研究中较人类有更低的试错成本。同时，该技术还可与转基因抗病育种技术相结合，以培育对某种疾病具有天然抗性的动物。

虽然CRISPR-Cas13技术的发展突飞猛进，但目前该技术仍有诸多不足有待解决。首先，sgRNA对靶位点的正确识别需要特定PAM序列，降低了靶区选择和相应sgRNA设计的灵活性，也使sgRNA的设计更加复杂化。其次，crRNA与目标核酸序列的结合可容忍一定程度的错配，进而导致脱靶效应(off-target effect)，阻碍了 CRISPR-Cas系统在生产实践中的使用。当前主要通过sgRNA和PAM序列的设计以及CRISPR系统的优化(Cas的构象和Cas-sgRNA的用量等)3个方面进行降低脱靶效率的研究来提升其作用的准确性。再者，基因编辑效率(efficiency of genome editing)的提高对于CRISPR-Cas基因编辑技术的开发应用同样重要。此外，由于RNA酶的广泛存在，核酸的检测和编辑很容易受到影响，因此，在CRISPR-Cas系统中偏向使用更长的sgRNA来放大核酸检测信号，以确保sgRNA没有被RNase消化变短或降解，从而有效避免假阴性结果[21]。而CRISPR-Cas13技术若想真正用于临床开发，其Cas13 蛋白以及gRNA在体内的精确递呈、代谢消除、免疫激活反应以及其他安全性相关指标均需要系统评估。若能解决以上诸多问题，将有利于Cas13技术的进一步完善，为传染病快速、准确的诊断以及抗病毒药物的开发提供新的思路和技术。

[1] Cong L, Ran F A, Cox D,etal. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823.

[2] Mali P, Yang L, Esvelt K M,etal. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science, 2013, 339(6121): 823-826.

[3] Shmakov S, Abudayyeh O O, Kira S. Makarova,etal. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems[J]. Molecular Cell, 2015, 60(3):385-397.

[4] Liu L, Li X, Ma J,etal. The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a[J]. Cell, 2017, 170(4):714-726.

文章来源：《中华疾病控制杂志》 网址: http://www.zhjbkzzz.cn/qikandaodu/2020/1222/522.html

上一篇：公安县2013年～2017年手足口病流行病学特征分
下一篇：人体成分分析仪指导营养治疗对妊娠期糖尿病患