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刊名:中华疾病控制杂志
曾用名:疾病控制杂志
主办:中华预防医学会;安徽医科大学
ISSN:1674-3679
CN:34-1304/R
语言:中文
周期:月刊
期刊分类:预防医学与卫生学
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论著

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技术在疫病诊断与抗病毒领域的研究进展

来源:中华疾病控制杂志 【在线投稿】 栏目:期刊导读 时间:2021-04-12

【作者】网站采编

【关键词】

【摘要】:1 CRISPR-Cas系统的发现 有规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)广泛存在于绝大多数细菌和古细菌中,其转录产生的crRNA(CRISPR-RNA)与反式激活的

1 CRISPR-Cas系统的发现

有规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)广泛存在于绝大多数细菌和古细菌中,其转录产生的crRNA(CRISPR-RNA)与反式激活的tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)共同构成引导RNA(guide RNA, gRNA),gRNA可引导核酸内切酶Cas蛋白(CRISPR associated protein)对噬菌体的基因片段进行切割,构成细菌的CRISPR-Cas免疫防御系统。人们发现可以通过人工合成的gRNA模拟自然的tracrRNA和crRNA结构,与Cas蛋白一起特异性识别和剪切核酸序列,构成新一代的基因编辑技术。2013年,2个团队[1-2]首次使用嗜热链球菌和化脓性链球菌构建Ⅱ型CRISPR-Cas9系统,随后该系统日趋成熟,并被广泛用于哺乳动物细胞的基因组编辑。 2015年,该家族内的另一系统CRISPR-CasC2c2[3](现称Cas13)被成功鉴定,与Cas9不同, Cas13结合和切割的对象为RNA。目前科学家们已经从Leptotrichiabuccalis(Lbu)、Leptotrichiawadei(Lwa)、Leptotrichiashahii(Lsh)以及Lachnospiraceaebacterium(Lba)等多种细菌中解析出了Cas13a结构,根据其来源不同分别称为LbuCas13a[4]、LwaCas13a[5]、LshCas13a[6]和LbaCas13a[7]。

2 CRISPR-Cas系统的分类

目前CRISPR-Cas系统分为2类、6型和30多种亚型[8]。其中1类系统(包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型)具有多个亚单位效应复合物,包括多个Cas蛋白;而2类系统(包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型)中效应物是种类单一、体积较大、多结构域的蛋白分子[9](见中插彩版图1)。研究表明,所有的CRISPR-Cas系统可能来源于同一个祖先,1类系统在进化过程中变为具有单一功能的Cas基因,同时丢失其他的Cas基因从而形成2类系统[10]。CRISPR-Cas13系统属于2类CRISPR系统的Ⅵ型,根据结构还可再细分为a、b、c、d四个亚型。

图1 两类CRISPR-Cas系统的结构差异及主要组成[9]

3 CRISPR-Cas13系统的作用机理

以CRISPR-Cas13a系统为例,高分辨率结构分析[4]显示细菌Leptotrichiabuccalis(Lbu)中解析出的LbuCas13a属于“双瓣叶”球状蛋白质结构,由1个crRNA识别瓣叶(Recognition lobe, REC)和1个核酸酶瓣叶(Nuclease lobe, NUC)组成,其NUC上有2个高等真核生物和原核生物核苷酸结合域(Higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding, HEPN)。

图2 LbuCas13a、crRNA、靶RNA复合物的复合结构[4]A:LbuCas13a的结构域 ; B:crRNA-靶RNA组成的双链RNA结构 ; C:LbuCas13a-crRNA-靶RNA组成整体结构的前后视图

Cas13a效应蛋白在识别靶RNA上的前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)(在Cas13a中称为Protospacer flanking site,PFS)并与其结合的过程中可发生构象变化,HEPN1结构域在靶RNA结合后向HEPN2方向移动,形成一个活化的HEPN催化位点。活化的HEPN催化位点表现出两种核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)活性,一种可将自身的pre-crRNA处理为crRNA,令一种表现为HEPN-RNase活性,对靶RNA或游离RNA进行切割[4]。

图3 Cas13a构象改变和HEPN活化以及表现RNase活性的过程[4]

Cas13a的催化位点位于外表面,所以一旦Cas13a被靶标RNA结合激活,就可以发挥非特异性RNA酶功能,裂解任何可触及的单链RNA(single-stranded RNA, ssRNA),而不论它们是否与crRNA同源或是否存在PFS,这种效应称为附带切割效应(Collateral effect)。相比之下,Cas9和Cas12只能在其HNH或RuvC两个核酸酶催化位点的引导链(gRNA)上切割靶标双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)[4]。Cas13b同样包含2个HEPN结构域,因此有类似Cas13a的功能,Cas13d在大多数方面表现与先前研究的Cas13类似,而Cas13c相关研究较少[11]。

4 CRISPR-Cas13技术的应用

自2015年C2c2(现称Cas13)系统被发现以来,其研究突飞猛进,并于2017年被《Nature Methods》评为2016年度革新技术[12]。该靶向RNA的核酸编辑技术在多个领域均有所应用。

4.1 RNA示踪 Cas13a蛋白的HEPN 结构域中Arg(精氨酸)和His(组氨酸)突变可形成核酸酶活性缺失的dCas13a(dead Cas13a),其能够结合目标RNA但不切割,因此成为一个可编程的RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP),利用其与特定RNA序列的结合特性,配合荧光标记技术可对胞内特定RNA片段进行示踪[13]。

4.2 临床诊断 通过设计与目标核酸互补的gRNA,并与Cas13蛋白组装可组成RNA检测报告系统。其报告基因通常一端为荧光基团,另一端是化学猝灭剂,当报告基因与样品中的特异性靶标核酸结合时,Cas酶将对报告基因进行裂解,从猝灭剂中释放荧光基团发出荧光,且信号可量化。利用该技术可对待测基因进行精确测量或定性分析[14]。

图4 应用报告基因reporter进行核酸检测[14]


文章来源:《中华疾病控制杂志》 网址: http://www.zhjbkzzz.cn/qikandaodu/2021/0412/859.html


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